细胞生物学常用技术.pptx

,细胞生物学常用实验技术,,cellularlevelSubcellularlevelMolecularlevel,,,显微技术细胞分离技术细胞培养技术细胞组分的分级分离细胞示踪技术细胞分子生物学技术,一、显微镜技术microscopyμm微米10-6mnm纳米10-9m埃10-10m一光学显微镜技术利用光线照明,将微小物体形成放大影像的仪器,1.显微镜的分辨率显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。d光学显微镜的分辨极限0.2μm,100μm,0.2μm,2.光镜标本切片的制备1固定定义将组织浸入化学试剂中，通过在细胞中大分子间形成交联，保持细胞中原有结构的形态和位置的过程。固定的目的A防止组织自溶或腐败B保持细胞原有的形态C保持细胞各种成分的原有位置常用固定剂乙醇、甲醛、戊二醛,2脱水定义借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程。常用的脱水剂酒精3包埋定义将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。常用的包埋剂液体石蜡、树脂4切片1-10μm,（5）染色采用某些化学物质特异性或选择性地与细胞内的某些成分相互作用，从而原位显示细胞某种成分或结构的方法A选择性染色考马斯亮蓝–蛋白质Brachet反应,,hematoxylin-eosin,B特异性染色酶底物抗原抗体,,,,,,,,,,,substrate,,,,,,,,,,antigen,antibody,*,*,*,,*,*,*,,,*,*,,,,,*,*,*,*,酶标记免疫组织化学技术荧光标记免疫荧光技术,3.荧光显微镜技术1原理荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光,,,（2）荧光显微镜的基本构造A紫外光光源B二向色镜反射短波光线，透过长波光线C滤光片,（3）常用的荧光染料A有机染料荧光素罗丹明FITC,B量子点quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素构成的半导体纳米结晶良好的光学稳定性抗光漂白性,,（4）应用A免疫荧光显微技术（Immunofluorescencemicroscopy）抗体荧光染料,B绿色荧光蛋白GFP,4.相差显微镜（phasecontrastmicroscope）1原理波长颜色振幅亮度速度相位,,,,,2应用活体细胞观察,5.激光扫描共焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscope）1原理在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。,单色激光光源光源后－照明针孔－点光源检测器前－探测针孔分层扫描三维重建,,共扼,（2）应用A细胞的三维重建B细胞定量荧光检测DNARNA蛋白质含量C细胞内Ca2pH动态检测D细胞间通讯,果蝇胚胎原肠胚,（二）电子显微镜技术利用电子与固体样品作用时所发出的信息,对样品进行微区观察和分析的技术亚显微结构超微结构1.电子显微镜的特点高分辨率理论上d0.002nm实际上d0.1nm生物标本d2nm高放大倍率1,000,000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,阴极,阳极,聚光镜（电磁透镜）,物镜中间镜投影镜,电镜照片,照相底片,真空、上下颠倒,2.透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope,TEM）1基本构造,2超薄切片的制备A固定戊二醛蛋白质锇酸CC膜结构,B脱水上升梯度乙醇305070809095100C包埋单体树脂加温聚合D切片500–700,,,,,,,,E重金属染色U醋酸双氧铀Pb柠檬酸铅,NADP酶反应,2.扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscopy,SEM）,1原理二次电子2分辨率3-10nm3样品的制备A固定B脱水C干燥临界点干燥D染色AuPt,透射电镜利用穿透标本的电子进行成像散射观察组织的二维切片扫描电镜利用标本表面发射的二次电子成像观察组织的表面三维结构,（三）扫描探针显微镜（Scanningprobemicroscope,SPM）1.扫描隧道显微镜使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。分辨率高可在非真空状态下工作直接观察大分子的三维结构,2.原子力显微镜通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。样品无需具有导电性可在三态下工作活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测,二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞,消化,EDTA细胞间连接,胰酶细胞外基质,,,,二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞,消化,EDTA细胞间连接,胰酶细胞外基质,,,,2.分离不同类型细胞1离心（centrifugation）大小密度形状小轻不规则大重圆形,,,,,,,,,,2免疫磁珠法,利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。,3流式细胞仪flowcytometry能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或化学特性的技术A原理抗原抗体*荧光标记B样品制备细胞悬液制备细胞固定细胞染色,B应用*细胞分选cellin10005000cells/sec*细胞大小测量*DNA含量测定*免疫表型分析*细胞功能分析*细胞凋亡研究,细胞周期分析,,药物处理前后HT29细胞的流式细胞分析结果,G0/G160.86S29.14G210.00,G0/G137.68S37.56G224.76,A,B,ND-1-QD605标记不同大肠癌细胞的流式细胞定量分析,4激光捕获显微切割技术（Lasercapturemicrodissection，LCM）从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法,工作原理及过程A制备组织切片B镜下将组织切片覆以薄膜C激光束切割特定细胞或区域D收集管收集,三、细胞培养技术（Cellculture）从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以至增殖的方法invitro用培养细胞做实验invivo用动物做实验,1.细胞培养的条件1固体表面培养瓶、培养皿2培养基常见培养基1640DMEM,3无菌无菌操作超净工作台、火焰消毒等培养液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）4其他温度37℃湿度100CO2浓度5,2.细胞培养的传代原代培养直接取材于有机体的细胞培养取材切割消化培养传代培养将原代培养存活的细胞从培养瓶中取出，以12以上的比例扩大培养原代培养传代培养保持分化特性,传代,,,,,3.细胞系（Cellline）在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。变异细胞细胞系HeLa人宫颈癌上皮细胞3T3小鼠成纤维细胞,,无限繁殖,相差显微镜观察培养中的HeLa细胞,4.细胞融合（Cellfusion）（1）定义在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。,异核体,杂交细胞,分裂,,（2）促融方法生物学方法仙台病毒化学方法PEG物理方法电脉冲打孔仪（3）应用A细胞核和细胞质间的相互作用B膜蛋白的流动性,C基因定位D单克隆抗体制备B淋巴细胞肿瘤细胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Mousecell,Humancell,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,division,,,,,,,,,,,,,,,,,E细胞周期相关因子的发现,四、细胞组分的分级分离通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的化学性质和功能进行研究的方法。匀浆分级分离分析,匀浆液,膜细胞器大分子,,低渗超声去污剂强制过滤研磨,,,细胞,破坏,（一）离心法用于分离细胞器和大分子,配平低温,1.差速离心法分离对象不同大小和形状的组分（细胞核、细胞器）具体方法由低速到高速逐级沉降repeat,2.速度沉降法分离对象不同大小、形状的组分沉降系数S比差速离心方法更精细具体方法在离心管中予装5-20蔗糖梯度的离心介质,,3.平衡沉降法分离对象密度不同的组分（与大小、形状无关）具体方法在离心管中予装一定密度梯度的离心介质（20-70蔗糖、CsCl）通常采用超速离心,,（二）层析法（柱层析）主要用于分离、纯化蛋白质,填充柱填料（固定相）流动相,1.离子交换层析层析介质阴离子或阳离子树脂分离原理电荷,2.凝胶过滤层析层析介质凝胶分离原理分子大小,3.亲和层析层析介质基质抗体底物分离原理亲和性,4.高压液相层析HPLC基质粒度小（3-10μm）、分辨率高、分离速度快,三电泳法主要用于分离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳分离对象核酸支持介质琼脂糖凝固点40-45℃不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液TAE\TBE染料溴化乙锭EB,三电泳法主要用于分离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳分离对象核酸支持介质琼脂糖凝固点40-45℃不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液TAE\TBE染料溴化乙锭EB,2.SDS-PAGE分离对象蛋白质蛋白质分子量、亚单位组成样品处理SDS阴离子表面活性剂β-巯基乙醇还原剂大小电荷形状支持介质丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺染色考马斯亮蓝银染特异性蛋白westernblotting,,,,SDS-PAGE,3.双向电泳根据蛋白质分子量、等电点分离等电聚焦等电点SDS分子量,,4.Western印迹技术将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗或生物素标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测.基本步骤1SDS-PAGE2转膜3抗体反应一抗孵育标记二抗孵育4显色,westernblotting,