食品中化学物质的生殖跟发育的毒性.doc

第八章 食品中化学物质的生殖和发育毒性生殖是使种族延续的各种生理过程的总称。生殖过程一般是指从配子形成直到胎儿娩出的整个过程，因此具有广泛的含义，其中包括精子的发生、卵的形成、配子的释放、受精、卵裂和胚泡发育、着床、胚胎发生、胎儿发育、分娩。而胎儿的娩出也并不意味着胎儿发育成熟的终止，从广义上说还应包括胎儿娩出后的新生儿期、哺乳期、直到性成熟的整个过程。随着我国人民生活水平提高，医疗卫生条件改善，新生儿死亡率大幅度降低，死因顺位也发生了明显的变化。1953 年先天畸形和先天心脏病死亡占总死亡的 9.77％，到 1979 年已占 37.50％，其死因顺位也由第四位上升为第一位。1988 年卫生部公布了自 1986 年 10 月至 1987 年 9 月在全国 29 个省、市和自治区同步进行的出生缺陷的监测资料，结果显示 1 243284 例围产儿中，先天畸形有 16172 例，发生率为 13.07％，其中神经管畸形占 3404 例。按此结果推算，我国每年有 30～40 万严重的先天缺陷儿出生。1973 年 Wilson 综合了 5 次国际会议的资料，将人类先天缺陷的成因归为三大类。即遗传因素染色体畸变和基因突变，占 25％ ，环境因素物理因素、宫内感染、母体疾病、药物与环境化学物质，占 10％，和原因不明的出生缺陷 可能是由于遗传因素与环境因素相互作用，占 65％。人们对先天缺陷和环境关系的认识是经历了一系列重大人间悲剧后才得到的。1940 年澳大利亚发生风疹大流行，次年婴儿中流行先天性白内障、耳聋、智力不全和先天心脏病。1945 年美国在日本广岛和长崎爆炸原子弹，受到核幅射的胎儿出生后患小头畸形和智力低下，婴儿一年内死亡率达 25％。1953 年日本水俣湾因氮肥厂排放含汞工业废水污染了水体，居民因食用污染的鱼类引起甲基汞中毒，两年后发现先天水俣病。1960 年前后，英、德、日本等国妇女以反应停thalidomide作镇静剂减轻早孕反应，出生了近万名短肢畸形儿海豹畸形，约占早孕期服药者新生儿的 1／3。1968 年秋，日本发生了因多氯联苯污染米糠油引起的中毒事故，中毒孕妇发生死产、早产和产下“油症儿” 。1961-1970 年间，美国在侵越战争中使用高于本国农用 13 倍浓度的落叶剂 2、4、5-T[含有杂质四氯二苯二恶英TCDDtetra-chlorodibenzo-p-dioxin]污染了大面积耕地和森林，造成妇女流产和产下患有小头症和 Down’s 综合征的畸形儿。另有报道工业发达的国家和地区先天缺陷的发生有增高的趋势。我国是发展中国家，优生优育，提高人口素质是我国的基本国策，所以应将发达国家已出现的问题引为前车之鉴。从 70 年代起，我国已开始了对药品、农药、食品添加剂和环境污染物的致畸研究，并把致畸试验、生殖毒性试验列为新药、农药、食品及首次进口化学品的安全性毒理学评价的重要组成部分。化学品对生殖发育的损害不仅与妊娠母体有关，带有致畸因子的雄性也会使胎仔发生畸形。例如给雄鼠经口染毒反应停，使之与未染毒的雌鼠交配，引起严重的胎仔畸形。接触二硫化碳男工的配偶发生流产，早产或分娩畸胎儿增多。对生殖发育有害的化学品不仅能作用于妊娠器官形成期，造成形态畸形，对妊娠前期的影响还可发生不育，对胎期的毒效应，可在出生后观察到发育、行为、代谢功能的障碍或子代肿瘤发生率增高。所以综合考虑有害环境因素对母体和父体的影响，将形态致畸与行为致畸结合起来进行观察，将生殖毒性和发育毒性结合起来进行研究已是发展的趋势。第一节 生殖毒性与发育毒性环境有害因素造成对亲代的生殖功能及对子代发育过程的有害影响的作用称为生殖毒性和发育毒性。两者关系密切，但不同研究者对其研究的侧重面有所不同，多数主张对生殖毒性和发育毒性应有所区分。一、生殖毒性reproductive toxicity生殖毒性指对雄性和雌性生殖功能或能力的损害和对后代的有害影响。生殖毒性既可发生于妊娠期，也可发生于妊前期和哺乳期。表现为外源化学物对生殖过程的影响，例如生殖器官及内分泌系统的变化，对性周期和性行为的影响，以及对生育力和妊娠结局的影响等。二、发育毒性developmental toxicity发育毒性指在到达成体之前诱发的任何有害影响，包括在胚期embryonic period和胎期fetal period诱发或显示的影响，以及在出生后诱发和显示的影响。发育毒性的主要表现为1. 发育生物体死亡death of the developing organism指受精卵未发育即死亡，或胚泡未着床即死亡，或着床后生长发育到一定阶段死亡。早期死亡被吸收或自子宫排出即自然流产，晚期死亡成为死胎。2. 生长改变 altered growth即生长迟缓growth retardation。能引起胚胎死亡和畸形的毒物多数能引起生长迟缓。一般认为胎儿的生长发育指标比正常对照的均值低 2 个标准差时，即可定为生长迟缓。胎鼠胸骨及枕骨骨化迟缓及低出生体重等是生长迟缓的较敏感指标。生长迟缓造成的局部发育不全可视为畸形，如脑小畸形和眼小畸形等。3. 功能缺陷functional deficiency包括器官系统、生化、免疫等功能的变化。功能缺陷往往要在出生后经过相当时间才能诊断。如听力或视力异常、行为发育迟缓等。4. 结构异常structural abnormality指胎儿形态结构异常，即畸形。致畸性teratogenicity是指化学物在胚胎发育期间引起永久的结构与功能异常的性质。致畸物teratogen是指出生前接触，诱发永久的结构与功能异常的物质。三、生殖与发育毒性的特点及靶器官生殖与发育过程包括配子精子与卵子 的发育与形成、交配、受精、合子形成与植入、胚胎形成与发育、分娩等阶段。生殖与发育过程的每个阶段所涉及的细胞或器官都可能成为外源化学物毒作用的靶。外源化学物对生殖与发育过程的损害主要有以下几个方面1. 亲性腺作用 性腺毒性 某些化学物可作用于性腺，影响生殖器官的发育与性腺成熟，或造成性腺组织病理学改变。例如氯乙烯单体可使睾丸曲细精管萎缩，氯化镉可引起小鼠卵巢出血，排卵抑制。某些化学物可影响配子的发生、增殖和成熟，使生殖细胞数量减少，功能减退及突变。例如过量接触二硫化碳的男工多见性机能减退，表现为性欲下降、阳萎。铅作业工人，特别是铅中毒患者易发生生殖细胞受损，导致精子数目减少，精子活动力降低，精子畸变率增加。生殖细胞受损的结果是不育、流产、死胎、畸胎和其他先天缺陷。生殖细胞突变造成的畸胎与妊娠期内接触毒物的致畸作用不同，前者突变发生于父体或母体的性细胞中，突变诱发的畸形可传给后代。后者突变发生在胚胎的体细胞中，引起的畸形不具有遗传性。已知的亲性腺毒物有多种，包括固醇类药物，化疗药物，有机磷和有机氯农药，镉、铅、汞和二硫化碳等。2. 亲胚体作用胚体毒性 embryotoxicity 某些化学物可作用于妊娠早期 即从受孕到胚体形成阶段，对胚体发育产生损害作用。某些化学物可以降低胚体对必需营养素的利用度，如 EDTA 降低胚体对微量元素的利用度，氨基蝶呤降低胚体对叶酸的利用度。当给予母体这些化学物时，可导致与缺乏这些必需营养素相似的胚体毒性。胚体毒性、胎体毒性fetotoxicity和胚胎毒性embryo-fetal toxicity是指由出生前接触引起对孕体的任何有害影 响 ，包 括 结 构 和 功 能 异 常 ， 或 这 种 影 响 在 出 生 后 的 表 现 。 这 些 术 语 与 有 害 作 用 诱 发 的 瞬 间 ／ 时期有关，而不考虑检测的时间。3. 亲胎盘作用胎盘毒性 placental toxicity 某些化学物可对胎盘造成损伤，改变胎盘血流量，降低胎盘对营养物质的转运，特异地干扰胎盘功能如内分泌和代谢功能 。例如5-羟色胺使小鼠动、静脉狭窄，胎盘血流量减少，胎盘转运功能障碍，引起死胎和先天畸形；甲基汞改变人胎盘滋养层微绒毛对不能代谢的氨基酸的摄取，而致功能致畸，即先天水俣病。患儿严重神经迟钝，共济失调，步行困难，语言、咀嚼，下咽困难和大发作性癫痫。除上述外，化学物还可引起胎期毒性，哺乳期毒性通过乳汁致婴儿中毒，如铅中毒 ，和通过对中枢神经系统及全身机能状态的毒作用来影响生殖过程。某些化学物还能经胎盘致癌transplacental carcinogenesis即致癌物由母血经胎盘进入胚胎，造成胚胎期接触，引发后代肿瘤。己烯雌酚diethylstibestml是第一个被证明的人类经胎盘致癌物transplacental carcinogen。孕妇孕早期作为保胎药服用时，女性后代可发现阴道透明细胞腺癌clear cell adenocacinoma、阴道腺癌adenosis 及阴道和子宫颈隆起；男性后代可发生附睾囊肿、睾丸营养性衰竭、睾丸囊性硬结、小阴茎畸形及精子异常。经胎盘致癌的发育致癌物developmental carcinogen通过动物实验已发现了 40 多种。化学物的生殖发育毒性有两个显著的特点一是生殖过程较机体的其他系统或功能对某些化学物的毒作用更为敏感，在成体系统毒性的未观察到有害作用的水平no observedad-verse effect level，NOAEL胎儿即可受到影响。例如妊娠期接触过不足以引起肿瘤的低剂量二乙基亚硝胺diethyllnitrosamine ，仔鼠成年后再次接触，则肿瘤发生率增加。二是损害作用不仅表现在接触化学物质的机体本身，还可影响其后代。例如母鼠接触高浓度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接触二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出现与子一代仔鼠几乎完全相同的畸变类型。第二节 生殖与发育毒性试验的目的和实验设计的要点评价化学物对生殖和发育的毒性需要三方面的资料，即环境流行病学，动物生殖与发育毒性试验和控制的临床研究。另外体外筛选试验还可为发育毒性提供初筛和补充。但是在一些新化学品和药品开发初期，显然不可能得到流行病学方面的资料，也不能直接对人体做临床研究，首先要靠动物试验来预测它们对人生殖与发育的危险。生殖与发育毒性研究的目的是揭示化学品／药品对哺乳动物生殖发育的任何有害影响，并将研究的结果与所有可以得到的其他药理学和毒理学资料联系起来，以推测对人可能造成的生殖危险。研究应包括成年动物和从受孕到子代性成熟的各个发育阶段接触受试物。为检测接触所致的即发和迟发效应，应连续通过一个完整的生命周期，即从亲代受孕到子一代受孕。为清楚地阐述各试验方案的组合，现将完整的生殖发育过程细分为如下阶段。A 阶段 交配前到受孕检查成年雄性和雌性生殖功能，配子的发育与成熟，交配行为，受精。B 阶段 受孕到着床检查成年雌性生殖功能，胚胎着床前发育、着床。C 阶段 着床到硬腭闭合检查成年雌性生殖功能，胎体发育，主要器官形成。D 阶段 硬腭闭合到妊娠结束检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长，器官的发育与生长。E 阶段 出生到断乳检查成年雌性生殖功能，新生仔对宫外生活的适应，断乳前的发育与生长。F 阶段 断乳到性成熟检查断乳后的发育与生长，对独立生活的适应，达到完全的性功能。以上不同阶段的组合可以构成许多可能的测试方案，各个国家和国际机构均发布了不同的试验准则和研究设计细则。本章介绍 ICH 准则和我国新药评价、农药及健康相关产品安全性评价中推荐的三段生殖毒性试验，一代和二代多代生殖毒性试验。本章将用如下术语来描述整个生殖与发育过程孕体[conceptus，包括胚体embryo 和胎体fetus]、幼体仔体 pup、成体adult、母体materal、父体paternal、亲代parental genetation和子代 offspring。实验设计的一般考虑如下一、动物选择必须以哺乳动物为实验对象。一般要求使用与其他毒理学研究中相同的物种与品系，以免必须进行另外的预试验。原则上实验动物对受试物的动力学、毒效学及其他有关参数应与人最接近，如代谢过程与生物转化应与人相近、胎盘结构与人相似、健康、生育力强、多产、孕期短、自发畸形率低、价廉、易得和操作方便。实际上没有一个固定物种可通用于精确模拟人类生殖毒性研究。在毒理学评价程序中，如果借助毒物动力学，药理学和毒理学的资料，能显示所选物种是人的生殖毒性实验的恰当模型，则用一种动物就够了。首选啮齿类中的大鼠，因用大鼠获得的其他实验结果有可比性并积累了大量的背景资料。在胚体胎体毒性研究中，传统上要求用第二种哺乳动物进行试验。家兔因其也有较广泛的背景资料和比大鼠更接近人的代谢类型而作为“非啮齿类”优选使用。在测试多巴胺类兴奋剂或降低催乳激素水平的化合物时，大鼠不是一个好的动物模型，因为大鼠需要催乳素来维持早孕，在这种情况时使用家兔可能更好。但家兔孕期长短不定32～36 天 ，有时缺乏毒性资料，对某些抗生素和消化道紊乱有易感性，在其他生殖毒性研究中较少用。二、接触选择1. 剂量 剂量选择应依据从所有已进行的药理学、急性和慢性毒性、以及动力学研究中得到的资料。高剂量应该在母体中产生轻度的毒性，如体重增长减少，体重增长速度改变与扰乱了内环境稳定的机理有关 、特异的靶器官毒性、药理学反应增强 如镇静、惊厥、阴道出血、流产等。在研究中，要对所观察到的效应进行剂量反应关系分析时，推荐至少用三个剂量水平和适当的对照组。低剂量不应有任何可归因于受试物的有害作用。中剂量组应在高、低剂量之间按等比级差定位，应引起最小的毒作用。如果对结果有怀疑，应增加第四个剂量组，以免剂量间隔过大。实验结果应提供最高未观察到有害作用水平的剂量，否则应对该受试物进行进一步深入的研究。在大多数情况下，最高限量剂量为 1gkgd假如仍未引起血浆和组织浓度增加时，可略微增加染毒剂量。在测试低毒物质时，假如剂量达到 1gkgd仍不产生胚胎毒性或致畸，则没有必要进行其他剂量水平的研究。假如在高剂量进行的初步研究中，有明显的母体毒性的证据而未显示对胚胎的有害作用，也没有必要进行其他剂量水平的研究。2. 接触途径与频率 应与人的接触途径相同，如果采用其他接触途径，必须依据动力学的资料。接触频率一般是一日一次，每日在相同时间染毒，并按体重调整染毒剂量。 3. 对照组 用与试验组相同的最大容量的赋形剂。当赋形剂可能有不良影响如减少食物的摄取和利用或影响受试物的作用时，应再设未处理对照组。第三节 三段生殖毒性试验用一组试验研究全部生殖毒性的终点是不可能的，所以在决定适当的策略和选择研究设计时，应考虑该受试物和其类似物质所有可能得到的药理学、动力学和毒理学资料。对大多数医药产品来说，三段生殖毒性试验设计通常是适当的。关键因素是各个生殖阶段之间不得有间隔，即在三个有关联的阶段接触受试物的时期至少有一天的重迭，并能直接或间接地评价生殖过程的所有阶段。三段生殖毒性试验由生育力和早期胚胎发育毒性试验，胚体胎体毒性试验致畸试验 和出生前后发育毒性试验 围产期毒性试验三部分组成图 8-1。三段的划分是按有害作用诱发的时期，而不考虑检测的时间。图 8-1 三段生殖试验图解Ⅰ生育力和早期胚胎发育毒性试验 Ⅱ胚体一胎体毒性试验致畸试验 Ⅲ出生前后发育毒性试验一、生育力和早期胚胎发育毒性试验1. 研究目的 评价化学物对配子成熟、交配行为、生育力、胚胎着床前和着床的影响包括前述生殖发育过程 A 和 B 阶段的评价 。雌性包括对动情期、输卵管运输、着床和胚胎着床前阶段发育的影响。雄性包括检测对功能的影响例如性欲、附睾的精子成熟等 。2. 动物 至少一种，首选大鼠。每性别、每组的动物数应足以对数据进行有意义的解释。建议每性别、每组 1620 窝。3. 给药期 应说明交配前染毒时间的长度并提供依据。一般采取雄性交配前四周开始重复染毒，直至交配成功。若要保证雌性受孕成功，雄性也可继续染毒，仍同笼至处死。雌性交配前两周开始染毒可覆盖至少两个完整的动情期 直至着床。交配前雄性染毒期限较以往的规范变动较大，1981 年 OECD 规定大鼠至少 10 周，小鼠 8 周。然而与雌鼠交配不是检测对精子发生影响的敏感的方法。实际上没有一个实例表明受试物对雄性生殖毒性的结论是仅靠雄鼠连续给药 8～10 周后与雌性交配得出的。精子存活率和形态学检查等进一步研究可为在生殖毒性研究观察到的毒作用提供更敏感的终点。另外，已知影响精子发生的外源化学物几乎总是影响减数分裂后阶段精子成熟前 3～5 周 。对雄性性腺组织和器官进行仔细的组织病理学检查Bouins 液固定，石蜡包埋，睾丸作横切片，附睾作纵切片，PAS 和苏木精染色 可对雄性生育力和精子发生影响提供有价值的补充信息。所以 ICH 准则将雄性染毒期缩短为 4 周，并结合组织病理学检测。4. 交配及受孕检查 雄大鼠给药 4 周，雌大鼠给药 2 周后开始同笼。交配期 23 周，交配比例 1∶1。实验程序应能识别出各窝的 2 个亲本，以避免不正确结果的分析和解释。雌性受孕检查一般靠查阴道涂片大鼠 或阴栓小鼠 。阴道涂片上有较多白色分泌物，镜检可见有较多有核上皮细胞，则提示雌鼠处于动情前期。大鼠性周期一般为 4～5 天，小鼠性周期为 4 天，动情前期向动情期移行多在夜间。人和几种常用实验动物早期发育时间表 8-1。阴栓是雄鼠精囊与凝固腺在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒，大鼠阴栓很易脱落。观察到阴道涂片上的精子或阴栓即提示受孕，检出日为孕 0 天，次日为孕 1天，以此推算孕龄。表 8-1 某些哺乳动物早期发育的时间早期发育的时间由排卵起的天数物种 胚胞形成 着床 器官形成期 妊娠长度小鼠 3～4 4～5 6～15 19大鼠 3～4 5～6 6～15 22家兔 3～4 7～8 6～18 ～33猴（恒河猴） 5～7 9～11 20～45 164人 5～8 8～13 21～56 2675. 终末处死 雌性一般在孕中期第 13-15 天终止妊娠。雄性在证实交配并受孕成功后处死检查。6. 观察项目 染毒期间观察雌、雄亲代 Po体征和死亡 至少 1 次／日，体重和体重改变至少 2 次／周，摄食量1 次／周 ，镜检雌性阴道涂片 交配期间 1 次／天和其他毒性研究中见到的靶效应。处死时所有成体均作尸体解剖和肉眼观察，进行所有动物的睾丸、附睾、卵巢和子宫的组织学检查，附睾或睾丸中的精子计数以及精子存活力测定。检查计数雌性的黄体数，着床数，吸收胎，死胎和活胎数。保存肉眼发现改变的脏器，以便进行可能的组织学评价，并保存足够的对照组的相应脏器，以供比较。对明显未孕的大鼠或小鼠而不是对家兔 ，可用硫化铵子宫染色鉴别胚胎着床前死亡。7. 结果评定 综合对 F0 代观察的各项指标和参数，用合适的统计方法分析和评价。在分析对胎体子一代，F 1的影响时，应考虑下述参数各组受影响的窝数比；每窝受影响的胎体的组平均百分率；受影响胎体总数比。在对生殖与发育毒性的试验结果进行推理统计显著性检验 时，应以窝litter[在两种性别均被处理时，以交配的双方mating pair]；在两代生殖毒性试验中，以亲代交配的双方，而不是以胎体或新生仔为比较的试验单位。二、胚体胎体毒性试验致畸试验 1. 研究目的 评价母体自胚泡着床到硬腭闭合期间接触受试物对妊娠雌性和对胚体胎体发育的有害影响，即前述生殖发育过程中的 C 和 D 阶段，主要包括增强了与非妊娠雌性有关的毒性，胚体胎体死亡、生长改变与结构异常。2. 动物 通常用两种，一种是啮齿类，首选大鼠，另一种是非啮齿类，最好是兔。若仅用一种动物，需提出正当理由。每组动物数应足以对数据进行有意义的解释。建议每组1620 窝。雌性宜用性成熟的，未交配过的动物。3. 给药期 从着床期到硬腭闭合，即器官形成期，大、小鼠孕期的第 615 天，兔孕期的 6～18 天。致畸实验日程见表 8-2。表 8-2 致畸试验日程大 鼠 小 鼠 兔交 配 90～120 日龄 60～90 日龄 成年末交配过的染毒时间 孕第 6～15 日 孕第 6～15 日 孕期 6～18 日龄处死取胎 孕第 20 日 孕第 18 日 孕第 29 日致畸试验除阴性对照外、应设阳性对照组。阳性对照大、小鼠可用乙酰水杨酸或浓缩鱼肝油，家兔可用 6-氨基烟酰胺。阴性与阳性对照组的作用分别是为自发畸形的发生和该批实验动物在试验条件下的敏感性提供资料。已经进行过致畸试验并确知所用试验动物有阳性结果的实验室，可略去阳性对照。4. 终末处死与标本制作 在分娩前一天处死怀孕母体，以防止自然分娩后，母体吞食畸形子。剖腹检查亲代受孕情况和胎体发育。除逐个检查所有胎体的存活和畸形外，尚需分别检查软组织和骨骼的异常。将每窝 50％胎仔经茜素红染色后，作骨骼检查。另外 50％胎仔 经 Bouin’s 固 定 后 ， 作 内 脏 检 查 。 当 使 用 新 鲜 标 本 的 显 微 解 剖 技 术 microdissec-tiontechniques检 查 软 组 织 改 变 时 对 家 兔 胎 体 检 查 的 最 好 方 法 ， 100％ 的 家 兔 胎 体 均 作 软组 织 和 骨 骼 检 查 。5. 观察项目 染毒期观察妊娠动物的体征和死亡1 次／日，体重和体重改变2 次／周，摄食量1 次／周 和在其他毒性研究中已证实的重要靶效应。有流产和早产征兆者处死并进行肉眼检查。处死时对所有妊娠动物进行尸体解剖和肉眼检查任何结构异常或病理改变。保存肉眼发现有改变的脏器，以便进行组织学评价，亦保存足够的对照组的相应脏器，以供比较。取出子宫，称带有胎体的子宫重，以得出妊娠雌性动物的净增重。计数黄体数，吸收胎数，活胎数与死胎数及着床点，称胎盘重并作肉眼评价，必要时可作组织学检查。称活胎体重，检查胎体性别，以及外观、内脏和骨骼畸形。6. 结果评定 致畸研究的发现应根据观察到的效应和产生效应的剂量水平进行评价。有必要考虑所用试验动物的物种／品系的历史的致畸性资料。致畸研究进行适当，应提供一个符合要求的 NOAEL未观察到有害作用水平 的估计。虽然将实验结果外推到人的可靠性有限，然而 NOAEL 的建立，使得能以采取适当的安全系数。对母体的终点评价指标包括体重、体重变化、食物消耗量和母体毒性体征及母体畸胎出现率等。对胎体影响的评价应包括受影响的窝数比、每窝受影响胎体数的组间均数、受影响的胎体总数比、畸胎率和某单项畸胎率等。7. 影响致畸作用的因素 致畸作用受多种因素影响，主要包括敏感期、遗传类型、剂量和母体毒性等。1致畸敏感期 实验证明器官形成期organogenesis period是发生形态结构畸形malation的关键期critical period。迅速改变细胞分裂速度对畸形发生是极为重要的，因为增加复制速度即增强了突变的可能性。器官形成期正是细胞分裂极旺盛的时期。例如发育中的大鼠在妊娠第 8～10 天之间，有 10 次细胞有丝分裂，产生 N210 新细胞N 表示器官形成期开始时的细胞数。人的器官形成期在人妊娠的第 3～8 周。60 年代反应停药物致畸事件就在人怀孕后的 20～35 天内，在无一般毒性的“安全剂量”[1mg／1gd] 下发生的，有人甚至在这阶段内只服过一次药。大多数器官又都有其对致畸作用的特殊敏感期，即“靶窗target windows”。形态畸形和功能缺陷的敏感期也不同。致畸实验的染毒时间，必须安排在器官形成期，才有可能观察到形态畸形的致畸效应。由于各物种妊娠期长短不同，敏感期的长短也不同，致畸试验的染毒时间需随动物种属而易。图 8-2 表示人、大鼠和家兔的致畸作用关键期的比较，并图解狭窄的“靶窗”概念。2 遗传类型 致畸作用存在明显的物种差异，这种差异是因代谢变化、胎盘种类、胚胎发育的速度和方式引起的。致畸物各有其易感物种和品系，易感性取决于机体的基因型。推测化学物生物转化成活性中间产物的速度和途径与遗传因子有关，而畸形仅发生在那些形成恰当代谢物的物种中。反应停是其中一例。反应停 4000mg／kg 对大鼠和小鼠尚不致畸，而对人 0.5～1.0mg／ kg 就有极强的致畸作用，这是由于人、猴和兔能将其代谢产生一个中间产物可能是一个极性的代谢物，或一个 anene 氧化物，而其他物种不产生。所以一个化学物在某些物种中是致畸的，在其他物种中产生很小或不产生影响，或是一个物种产生的畸形，可完全不同于在另一个物种中诱发的畸形。所以在筛选致畸物时，强调采用包括非啮齿类在内的两种动物中进行试验，可以减少因动物不敏感而出现的假阴性。3 化 学 物 的 剂 量 各 种 致 畸 物 都 有 其 引 发 致 畸 作 用 的 阈 剂 量 。 不 同 致 畸 物 又 有 不 同 类型 的 剂 量 效 应 关 系 ， 反 映 了 不 同 外 源 化 学 物 胚 胎 毒 性 作 用 的 特 点 。 一 般 地 说 ， 所 用 的 剂 量高 于 该 化 学 物 致 畸 作 用 的 阈 剂 量 时 ， 可 使 致 畸 范 围 扩 大 、 程 度 加 重 、 靶 窗 延 长 ， 再 增 大 则 出现 胚 胎 死 亡 。 而 由 于 有 缺 陷 的 胚 胎 死 亡 ， 畸 形 率 反 会 降 低 。 剂 量 再 进 一 步 增 大 ， 则 可 造 成 母体 的 死 亡 。典 型 的 致 畸 作 用 的 剂 量 -反 应 曲 线 的 斜 率 很 大 ， 从 最 大 未 观 察 到 有 害 作 用 剂 量 到 胚 胎100％ 死亡的剂量只差 2～4 倍。如给孕小鼠腹腔注射环磷酰胺 5～10mg，未见畸形发生，而 40mg／kg 即可引起胚胎 100％死亡。从最大未观察到有害作用剂量到胚胎死亡剂量间的剂量带，称为致畸带。致畸带越宽的致畸物，致畸危险性越大。掌握致畸作用中剂量反应关系的规律，对致畸实验中适当剂量的确定具有重要意义。剂量过低，不足以显示确实存在的致畸作用。剂量过高，引起大量胚胎死亡，畸胎数减少，或对母体毒作用过强，不能辨明是致畸物的作用，还是母体毒性的继发作用，均影响结果的正确判断。图 8-2 人、大鼠和家兔的致畸作用关键期的比较，短线表示“靶窗”4其他因素 化学物的理化性质与致畸作用有关。若外来化学物或其代谢产物的分子量小、极性小、高脂溶性、未与母体血浆蛋白结合，则易穿透胚盘屏障，到达胚胎体内。染毒途径也影响致畸试验结果，大鼠受孕第 7～14 天经口给以 EDTA，引起 70％胎鼠畸形，但以同样剂量皮下注射，对母体毒性增加，却未见明显的胎鼠畸形。同样是经口染毒，灌胃和经饲料、饮水染毒在动力学也有差别。如苯菌灵Benomyl灌胃染毒致畸，而经饲料染毒则否。反应停对大鼠灌胃结果为阴性，而经饲料染毒几乎全部胚胎致死。母体状况也是影响致畸作用的重要因素，见下。8. 母体毒性与致畸的关系 母体毒性是指对怀孕母体的特异的直接的作用 或非特异的间接的作用的有害影响。在致畸试验中，剂量选择应避免用诱发母体毒性的剂量，因为若怀孕母体中毒，而不能正常进食，由营养缺乏对胎儿产生的影响可能比化学物本身的影响还大。例如羟基脲染毒引起怀孕家兔子宫血流量降低，出现胚胎毒性。二氟尼柳Diflunisal引起孕兔溶血性贫血，严重时伴发孕体中轴骨骼畸形。己酰唑胺诱导小鼠胎体畸形明显地与母体血内碳酸过多和血钾过少有关。苯妥因对小鼠的致畸性可能继发于母体心率降低，组织内氧分压降低。但胚胎毒性并不是任何时候都是继发的、与母体毒性同时发生的，通常二者间很难建立因果关系。为证明胚胎毒性是继发于母体毒性的一个特殊的参数，必须显示所有胚胎毒性的母体也有母体毒性，以及对此发育影响的严重性和发生率与母体毒性相关。一般认为胚胎死亡和生长迟缓是母体中毒剂量水平引起的胚胎毒性表现，但先天畸形是否继发于母体毒性还有争论，1984 年 Khera 提出各种化学物质的母体毒性和致畸作用之间有三种关系①母体毒性不伴致畸作用；②母体毒性伴有包括腭裂在内的多种畸形谱；③母体毒性伴有特征性的畸形谱。判断第二类化学物质的致畸性是很困难的。腭裂是小鼠在妊娠期禁食和禁水诱发的最主要的畸形。但也是多种致畸物如糖皮质类固醇在不引起母体毒性的剂量水平特异性诱发的畸形。为了区别腭裂是由于化学物质对胚胎的致畸作用还是继发于母体毒性的非特异毒性作用，就需要观察饲料和饮水消耗量，母体体重及母体内稳态改变即组织病理学，肾和肝功能异常，血液学改变，药理作用及其他可能的毒作用。第三类化学物质引起的特征性畸形包括露脑，开眼，融合肋，缺肋，多肋及胸骨节融合或杂乱。这些缺陷的严重性和发生率与母体毒性直接相关，无母体毒性的剂量水平则无或罕见。Khera 认为这些缺陷是由于母体毒性，并不反映化学物质的致畸性。但大多数学者认为母体毒性可能引起肋骨和胸骨的微小变异，但不会引起露脑及开眼等重要畸形。9. 致畸物及发育毒物的危险度评定 由于致畸作用的机理尚未充分阐明，所以致畸物危险度评定方法也没有完全统一。本章只介绍三种方法，供实际工作中参考。1 致畸指数判断致畸指数母体 LD50／胎体最小致畸剂量通过致畸指数可以判断致畸带的宽窄和致畸性的强弱。致畸指数小于 10 为一般不致畸，致畸指数 10100 为致畸，大于 100 为强致畸。2 化学物致畸潜力分类和安全系数确定根据动物试验中发育毒性效应的类型、严重性和发生率将化学物分为四类，并规定各类型的不同的安全系数范围表 8-3，用以评定待测物发育毒性的危险度。表 8-3 致畸化学物的分类基 准 A 类 B 类 C 类 D 类1. 最小母体中毒剂量与最小致畸剂量之比值远大于 1 大于 1 或两剂量间有很大重叠小于 1 母体中毒时无致畸2. 畸胎率 高，与剂量有关高，与剂量有关 低，但与剂量有关 ----3. 较低剂量时畸形的类 有特定的器官 一般为多发性，也 无特异性，广泛多 ----型 系统 可能有特定的特点 发4. 靶细胞 特定细胞 特定细胞 泛化、非特定细胞 不 详5. 安全系数范围 ～400 ～300 ～250 ～100国际生命科学院International Life Sciences Institute，ILSI 1989 年提出 3 ICH 人类用药危险度分类 研究设计中规定，一旦一种新药被批准，就要根据动物发育毒性的研究结果和从人类使用经验得到的信息但通常得不到 ，将该药品在妊娠用药类别中定位共 5 类，并要求医生在开处方时遵守，以使怀孕妇女按规定使用这些药品。妊娠用药类别见表 8-4。表 8-4 妊娠期用药类型动物实验结果人群研究结果 － 无可用资料 X 或 D X 或 D X 或 D－ B A A 或 B无可用资料 Cl B C2A、B、C 2仅在如果明显地需要时，在怀孕期间可使用。C1仅在如果证明可能的效益与对胎儿的可能的危险比较是可取时，在怀孕期间可使用。D如果在怀孕期间使用，应通知病人对胎儿可能的危害。X在怀孕或可能怀孕的妇女中禁止使用。⑷ 根据动物试验人群调查资料对致畸物分级，这是由欧共体（EEC）和经济与发展组织（OECD）所建议。表 8-5 致畸物的参考分级标准级 别 分 级 依 据 对人类危险性1 已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷子 已证实对人致畸2A 对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系 对人可能致畸2B 动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料 对人可能致畸3 尚无结论性肯定致畸证据或资料不足 可以认为对人无致畸作用，但应继续研究，4 动物试验阴性，人群调查结果未发现致畸 对人无致畸作用 10. 确认人类致畸物的标准 尽管外源化学物在动物试验中阳性致畸物的比率很高，但确认的人类致畸物还比较少。由于没有完全适合的动物模型，在确认人类新的致畸物时，不能把动物实验的结果轻易外推到人，还必须结合环境流行病学和有控制的临床研究的结果进行评价。Wilson 提出的确认人类新的致畸物的标准如下1 一种特殊的缺陷或几种缺陷并发 综合征的频率突然增加。2 缺陷的增加与某种已知的环境改变，如一种新药的广泛使用巧合。3 已知在妊娠的特殊阶段接触环境的改变，产生有特征性缺陷的综合征。4 缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿产生的其他普通因子。确认的人类致畸物见表 8-6。