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膳食纤维的测定.doc

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膳食纤维的测定.doc

膳食纤维的测定膳食纤维的测定方法 酶-重量法 1.原理 样品分别用 α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维TDF是先酶解,然后用乙醇沉淀,再将沉淀物过滤,将TDF 残渣用乙醇和丙酮冲洗,干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维IDF 和 SDF是酶解后将 IDF 过滤,过滤后的残渣用热水冲洗,经干燥后称重。SDF 是将上述滤出液用 4 倍量的 95乙醇沉淀,然后再过滤,干燥,称重。 TDF、IDF 和 SDF 量通过蛋白质、灰分含量进行校正。 2.适用范围 AOAC991.43 本方法适用于各类植物性食物和保健食品。 3.仪器 3.1 烧杯400 或 600ml 高脚型。 3.2 过滤用坩埚玻料滤板,美国试验和材料学会ASTM40-60μm,Pyrex 60mlCorning No.36060 buchner,或同等的。如下处理 1 在灰化炉 525灰化过夜。炉温降至 130以下取出坩埚。 2 用真空装置移出硅藻土和灰质。 3 室温下用 2清洗溶液浸泡 1 小时。 4 用水和去离子水冲洗坩埚;然后用 15ml 丙酮冲洗然后风干。 5 在干燥的坩埚中加 0.5g 硅藻土,在 130烘干恒重。 6 在干燥器中冷却 1 小时,记录坩埚加硅藻土重量,精确至 0.1mg。 3.3 真空装置 1 真空泵或抽气机作为控制装置。 2 1L 的厚壁抽滤瓶。 3 与抽滤瓶相配套的橡皮圈。 3.4 振荡水浴箱 1 自动控温使温度能保持在 982。 2 恒温控制在 60。 3.5 天平分析级,精确至0.1mg。 3.6 马福炉温度控制在 5255。 3.7 干燥箱温度控制在 105 和 1303。 3.8 干燥器用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在 130烘干过夜。 3.9 PH 计注意温控,用 pH4.0、7.0 和 10.0 缓冲液标化。 3.10 移液管及套头容量 100μl 和 5ml。 3.11 分配器或量筒 1 150.5ml,供分配 78的乙醇,95的乙醇以及丙酮。 2 400.5ml,供分配缓冲液。 3.12. 磁力搅拌器和搅拌棒。 4. 试剂 全过程使用去离子水,试剂不加说明均为分析纯试剂 4.1 乙醇溶液 1 85加 895ml95乙醇在 1L 量筒中,用水稀释至刻度。 2 78加821ml95乙醇在 1L 量筒中,用水稀释至刻度。 4.2 丙酮 4.3 供分析用酶在 0-5下储存。 1 热稳定 α-淀粉酶溶液Cat. No. A3306,Sigma Chemical Co.,St. Louis,MO63178,或 Termamyl 300L,Cat. No. 361-6282,Novo-Nordisk,Bagsvaerd,Denmark,或等效的酶。 2 蛋白酶Cat. No. P3910,Sigma Chemical Co.,或等效的。当天用MES/TRIS 缓冲液中现配 50mg/ml 酶溶液。 3 淀粉葡糖苷酶溶液Cat. No. AMG A9913,Sigma Chemical Co.,或等效的。 4.4 硅藻土酸洗Celite 545 AW,No.C8656,Sigma Chemical Co.,或等效的。 4.5 洗涤液两者挑一。 1 铬酸120g 重铬酸钠 Na2Cr2O72H2O,1000ml 蒸馏水和 1600ml 浓硫酸。 2 实验室用液体清洁剂,预备急需清洗的Micro,International Products Corp.,Trenton,NJ08016,或等效的。用水配制 2溶液。 4.6 MES-TRIS 缓冲液0.05mol/L,温度在 24时 pH 值为 8.2。 1 MES2-N-吗啉代磺酸基乙烷No.M-8250,Sigma Chemical Co.或等效的。 2 TRIS三羟羟甲基氨基甲烷No.T-1503,Sigma Chemical Co.或等效的。在 1.7L 的蒸馏水中溶解 19.52gMES 和 12.2gTRIS,用 6mol/L NaOH 调 pH 到8.2,用水定容至 2L。注意24时的 pH 为 8.2,但是,如果缓冲液温度在20,pH 就为 8.3,如果温度在 28,pH 为 8.1。为了使温度在 20-28之间,需根据温度调整 pH 值。 4.7 盐酸溶液0.561mol//L,加 93.5ml6mol/L 盐酸到 700ml 水中,用水定容至 1L。 5. 操作方法 5.1. 样品制备 1 固体样品如果样品粒度,0.5mm,研磨后过 0.3-0.5mm40-60 目筛。 2 高脂肪样品如果脂肪含量,10,用石油醚去脂。每克样品用 25ml,每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜,慢慢将石油醚倒出,共洗三次。 3 高碳水化合物样品如果样品干重含糖,50,用 85乙醇去除糖份,每克样品每次 10ml,共洗三次轻轻倒出,然后在 40烘箱中不时翻搅干燥过夜,并研磨过0.5mm 筛。 5.2. 样品消化 1 准确称取双份 1.0000.005g 样品M1 和 M2,置于高脚烧杯中。 2 在每个烧杯中加入 40ml MES-TRIS 缓冲液,在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。防止团块形成,使受试物与酶能充分接触。 3 用热稳定的淀粉酶进行酶解处理加 100μl 热稳定的淀粉酶溶液,低速搅拌。用铝箔片将烧杯盖住,在 95-100水浴中反应 30 分钟。 起始的水浴温度应达到 95。 4 冷却所有烧杯从水浴中移出,凉至 60。打开铝箔盖,用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离,以使样品能够完全的酶解。用 10ml 蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。 5 用蛋白酶进行酶解处理在每个烧杯中各加入 100μl 蛋白酶溶液。用铝箔盖住,在 60持续摇动反应 30 分钟开始时的水浴温度应达 60,使之充分反应。 6 pH 值测定30 分钟后,打开铝箔盖,搅拌中加入 5ml0.561mol/L HCL 至烧杯中。60时用 1mol/L NaOH 溶液或 1mol/L HCL 溶液调最终 pH 为 4.0-4.7。注意当溶液为 60时检测和调整 pH,因为在较低温度时 pH 会偏高。 7 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理搅拌同时加 100μl 淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住,在 60持续振摇反应 30 分钟,温度应恒定在 60。 5.3 测定 5.3.1.总的膳食纤维测定 1 用乙醇沉淀膳食纤维在每份样品中,加入预热至 60的 95乙醇 225ml,乙醇与样品的体积比为 41。 室温下沉淀 1 小时。 2 过滤装置用 15ml78乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。 3 酶解过滤,用 78乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。注意如果一些样品形成胶质,用刮勺破坏表面,以加速过滤。 4 抽真空,分别用 15ml 的 78乙醇,95乙醇和丙酮冲洗残渣各 2 次,将坩埚内的残渣抽干后在 105烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量,包括膳食纤维残渣和硅藻土,精确称至 0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣重。 5 蛋白质和灰分的测定取成对的样品中的一份测定蛋白质,用 本书前述或 GB-960.52 方法测定。用N6.25 作为蛋白质的转换系数。 分析灰分时用平行样的第二份在 525灼烧 5 小时,在干燥器中冷却,精确称至0.1mg,减去坩埚和硅藻土的重量,即为灰分重量。 5.3.2 .不溶性膳食纤维测定 1 称适量样品按 5.2 进行酶解,过滤前用 3ml 水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上,保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。 2 过滤并冲洗烧杯,用 10ml70水洗残渣 2 次,然后再过滤并用水洗,转移到 600ml 高脚烧杯,保留用以测定可溶性膳食纤维,按 5.3.3。 3 用抽滤装置,分别用 15ml78乙醇,95乙醇和丙酮各冲洗残渣 2 次。 注意应及时用 78乙醇、95乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。 4按 5.3.1.5 用双份样品测定蛋白质和灰分。 5.3.3.可溶性膳食纤维测定 1 将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到 600ml 高脚烧杯中,对比烧杯和滤过液,估计容积。 2 加约滤出液 4 倍量已预热至 60的 95乙醇。或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至 80g,再加入预热至 60的 95乙醇 320ml。 3 室温下沉淀 1 小时。下面按 5.3.1 测定总膳食纤维,从“湿润和重新分布硅藻土“。 6. 计算 TDF、IDF、SDF 均用同一公式计算 膳食纤维DF,g/100g测定 DF{[R1R2/2]-P-A}/[M1M2/2]100 式中R1 和 R2双份样品残留物重量mg P 和 A分别为蛋白质和灰分重量mg M1 和 M2样品重量mg

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